Raziskave

Predstavitev projekta MAGIC


POVZETEK

Materino mleko je pomemben vir bakterij za črevesje dojenčka. Proces poseljevanja mlečne žleze še ni povsem raziskan, vendar najverjetneje bakterije tvorijo biofilme na mlečnih vodih. Kljub temu, da je koncept mlečne žleze kot mikrobnega habitata (z lastno mikrobioto in ne kot bakterijska kontaminacija), že uveljavljen, proces mikrobnega poseljevanja mlečne žleze in morebitne tvorbe biofilmov še ni pojasnjen. Najverjetneje gre razloge iskati tudi v pomanjkanju primernih, dobro proučenih in vitro celičnih modelov mlečne žleze. Trenutno ni na voljo modelov in vitro, s katerimi bi lahko proučevali mehanizme mikrobnega poseljevanja mlečne žleze in morebitne tvorbe biofilmov. Glavni cilj projekta je razviti raziskovalno orodje za proučevanje mehanizmov mikrobnega poseljevanja mlečne žleze, kar pomeni temeljito proučiti celični model za proučevanje mikrobnega poseljevanja mlečne žleze (angl. model for study of mammary gland microbial colonisation (MAGIC)) in vitro. Poleg tega je cilj projekta preveriti uporabnost modela MAGIC za proučevanje vpliva probiotikov in sevov, ki povzročajo mastitis, na razvoj mikrobiote mlečne žleze.

Za dosego ciljev raziskave bomo uporabili trajno celično linijo MCF10A. MCF10A je že poznana in dobro proučena celična linija, ki pa še ni bila uporabljena za raziskave odnosov mikrobiota-gostitelj. Če celice MCF10A nasadimo na porozno membrano, izražajo močan polariziran fenotip, ki je značilen za celice epitelija mlečnih vodov. Projekt bo razdeljen v več delovnih sklopov. Za namene projekta bomo v prvem delovnem sklopu pridobili vzorce humanega mleka zdravih prostovoljk med 4-im in 8-im tednom po porodu. Poleg tega bomo optimizirali pogoje gojenja in proučili odziv celic na poroznih membranah po izpostavitvi bakterijskim kulturam in surovemu materinemu mleku. V glavnem poskusu (delovni sklop 2 )bomo celice MCF10A nasadili na porozne membrane in jih gojili do konfluentnosti. Potem bomo gojišče na apikalni strani zamenjali s steriliziranim (kontrola) ali surovim materinim mlekom. Da bi posnemali pretok mleka med dojenjem, bomo mleko zamenjali s svežim vsakih 4-8 ur. Po 24 do 48-ih urah bomo opravili različne analize. V tretjem sklopu bomo testirali uporabnost modela MAGIC za študij vpliva probiotikov in bakterijskih sevov, ki povzročajo mastitis, na pripenjanje bakterij, ki izvirajo iz mikrobiote humanega mleka. Za karakterizacijo modela MAGIC in proučevanje vpliva potencialnih probiotikov na epitelij bomo uporabili najsodobnejše metode: za ugotavljanje in/ali kvantifikacijo sestave mikrobiote mleka in pripenjanja bakterij na epitelij – globinsko sekvenciranje 16S rDNA pomnožkov in qPCR, za proučevanje pripenjanja bakterij in tvorbe biofilma – vrstično elektronsko mikroskopijo ter za kvantifikacijo odziva epitelne celične linije na vzorce mleka in pripete bakterije – analizo transkriptoma z RT-qPCR in/ali globinskim sekvenciranjem celokupne bakterijske RNA.

Z zbranimi rezultati bomo pridobili nova znanja o tem, katere bakterije iz humanega (materinega) mleka so se sposobne pripeti na epitelij v mlečnih vodih, ali te bakterije tvorijo biofilm in kakšen je vpliv mikrobiote v mleku na epitelne celice. Dobro proučen celični model za študije mikrobnega poseljevanja mlečne žleze bo omogočil nove možnosti raziskovanja tudi na drugih področjih fiziologije mlečne žleze, kot je npr. vpliv bioaktivnih komponent mleka na mikrobioto mlečne žleze ali pa vpliv patogenih bakterijskih sevov na mikrobno poseljevanje. Ker nedavne študije kažejo, da lahko nekatere bakterije v mlečni žlezi predstavljajo pomemben dejavnik tudi pri razvoju raka dojke, bi tako in vitro orodje prineslo tudi nove možnosti za raziskave raka.

Znanstvena izhodišča in predstavitev problema

Perinatalno obdobje je ključno pri razvoju novorojenca. Njegova črevesna mikrobiota je v tem obdobju neposredno odvisna od materinega mleka. Materino mleko je kompleksna biološka tekočina, s sestavo, ki je prilagojena prehranskim potrebam rastočega dojenčka. Poleg tega, lahko prisotne bioaktivne snovi v mleku, kot so imunoglobulini, imunokompetentne celice, maščobne kisline, oligosaharidi in glikoproteini, zaščitijo novorojenca pred različnimi nalezljivimi boleznimi. Materino mleko je pomemben vir bakterij za črevesje novorojenca, vključno s striktnimi anaerobi, ki so običajni poseljevalci črevesa. Proces poseljevanja mlečne žleze še ni povsem raziskan, vendar najverjetneje bakterije tvorijo biofilme na mlečnih vodih. Trenutno ni na voljo modelov in vitro, s katerimi bi lahko proučevali mehanizme mikrobnega poseljevanja mlečne žleze in morebitne tvorbe biofilmov. Dobro razumevanje osnovnih načel mikrobnega poseljevanja mlečne žleze je nujno tudi za razumevanje razvoja mikrobne disbioze in z njo povezanih infekcij, kot je npr. mastitis. Predmet intenzivnih raziskav je tudi nejasna vloga mikrobiote mlečne žleze pri razvoju in preprečevanju pojava rakavih tvorb v mlečni žlezi.

Glede na to, da je dolgoročni cilj EU zmanjševati uporabo živalskih modelov v znanstvene namene, je nujen razvoj novih in vitro celičnih modelov. Dobro proučen in vitro model mikrobnega poseljevanja mlečne žleze bi omogočil številnejše študije o mikrobioti mlečne žleze in o možnostih njene modulacije. Poleg tega se zdi zelo obetaven pristop, pri katerem bi s probiotiki vplivali na mikrobioto mlečne žleze in s tem na zdravje mlečne žleze. Tako bi lahko preko dojenja vplivali na črevesno mikrobioto novorojenca, ki pomembno zaznamuje zdravstveno stanje človeka za celo življenje ter je ključnega pomena v razvoju/preprečevanju kroničnih bolezni.

Cilji predlagane raziskave

Inovativni metodološki princip projekta je razviti raziskovalno orodje za proučevanje mehanizmov mikrobnega poseljevanje mlečne žleze. Tovrstno orodje bi odprlo nove možnosti za proučevanje vplivov različnih dejavnikov, ne le na proces mikrobno kolonizacije, ampak tudi na odziv epitelnih celic mlečne žleze. Da izpolnimo to nalogo, smo si zadali dva glavna cilja:

  • Prvi cilj projekta je vzpostaviti in z modernimi tehnikami (transkriptomika, qPCR in elektronska mikroskopija) temeljito proučiti celični model za proučevanje mikrobnega poseljevanja mlečne žleze (angl. model for study of mammary gland microbial colonisation (MAGIC)) in vitro. Tovrstni model bi omogočil raziskovanje medsebojnega vpliva epitelnih celic mlečne žleze in bakterij ter morebitnega razvoja biofilmov.
  • Drugi cilj projekta je preveriti uporabnost modela MAGIC za proučevanje vpliva probiotikov in sevov, ki povzročajo mastitis, na razvoj mikrobiote mlečne žleze. Posebno pozornost bomo posvetili tistim potencialnim probiotičnim sevom, ki smo jih v preteklih raziskavah izolirali iz materinega mleka, se dobro pripenjajo na epitelne celice mlečne žleze, pozitivno vplivajo na proces mikrobnega poseljevanja ter obenem povzročajo pozitiven odziv epitelnih celic.

Pregled in analiza dosedanjih raziskav in relevantne literature

Razvoj naprednih gojitvenih in od gojenja neodvisnih tehnik v zadnjem desetletju je omogočil nova spoznanja o sestavi mikrobiote materinega mleka. To je kompleksen ekosistem, ki vsebuje predstavnike številnih bakterijskih rodov, kot so Streptococcus, Staphylococcus, Weissella, Clostridium, Serratia, pa tudi propionibakterije, bifidobakterije in mlečnokislinske bakterije1, 2. Osnovni vir bakterij v mleku doječe matere naj bi bila koža in novorojenčkova ustna votlina, ki se z vaginalno in črevesno mikrobioto matere okuži med porodom. Med dojenjem naj bi se bakterije preko novorojenčkovih ust preselile in naselile na področju areol in v mlečnih vodih3-5. Za nekatere skupine bakterij (striktno anaerobne vrste, laktobacili in bifidobakterije) pa je zelo malo verjetno, da izvirajo iz kože. Tako kar nekaj študij nakazuje, da lahko bakterije iz črevesja pridejo v materino mleko tudi po t.i. črevesno-mlečni poti, preko z mukozo povezanega limfatičnega sistema. Pri tem naj bi bile vpletene dendritične celice in/ali makrofagi imunskega sistema matere6, 7. To hipotezo potrjuje tudi nedavna študija, s katero so dokazali, da je določen sev vrste Bifidobacterium breve prešel iz matere na otroka preko dojenja8. Poleg tega so ugotovili, da bakterije poseljujejo epitelij mlečne žleze in najverjetneje tudi mlečne vode mlečne žleze, ki ni v laktaciji9, 10. Natančen mehanizem poseljevanja mlečne žleze med nosečnostjo še ni poznan, nekatere anatomske spremembe v sistemu mlečne žleze med nosečnostjo pa omogočajo dobre pogoje za tvorbo biofilmov na areoli in/ali v mlečnih vodih11. Zanimivo je, da je tvorba biofilma eden ključnih dejavnikov patogenosti pri mastitisu, ki ga povzroča Staphylococcus aureus. Pri tem velja omeniti, da je preprečevanje tvorbe biofilmov eden od možnih mehanizmov delovanja probiotikov, pri preprečevanju nekaterih okužb12.

Oblikovanje in sestava mikrobioma humanega mleka sta odvisni od različnih/številnih dejavnikov, kot so način poroda, dojenje, življenjski slog in zdravstveno stanje matere ter prehrana (uživanje antibiotikov ali probiotikov)11, 13-15. Številne študije v preteklosti so pokazale neposredni vpliv zaužitih probiotikov na mikrobioto humanega mleka. Študija, ki smo jo izvedli na brejih miših je pokazala, da probiotiki lahko vplivajo na bakterijsko sestavo mezenteričnih limfnih vozlov in mikrobioto mlečne žleze in s tem na zdravje mlečne žleze in nenazadnje tudi na zdravje novorojenca16. Uživanje probiotikov se je izkazalo kot učinkovita preventiva17 ali kot alternativa zdravljenju mastitisa z antibiotiki18, 19. Ker je dokazov o endogenem prehodu probiotikov iz črevesja v mlečno žlezo malo20, se zdi izkoriščanje povratnega toka mleka med dojenjem obetaven pristop, kadar želimo s probiotiki ugodno vplivati na mikrobioto mlečne žleze (npr. preprečevanje mastitisa) ali pa preko dojenja ugodno vplivati na novorojenca (mleko kot medij za dostavo probiotikov). Nedavni študiji sta pokazali, da so imele ženske, ki so imele v preteklosti raka na dojkah, značilne razlike v sestavi mikrobiote iz tkiva in spirka dojke, v primerjavi z ženskami brez preteklih rakavih obolenj21, 22. Zato se zdi smiselno proučevati možnost uporabe probiotičnih bakterij in modulacije mikrobiote mlečne žleze, kot preventiva ali zdravljenje raka dojke. Primerni in vitro celični model kolonizacije mlečne žleze bi lahko omogočil testiranje probiotikov, ki bi izboljšali zdravje mlečne žleze. Selekcija specifičnih sevov, bi tako morala biti osnovana na varni uporabi pri ljudeh, zmožnosti krepitve epitelne pregrade, izražanju protimikrobnih lastnosti in zmožnosti degradacije oziroma detoksikacije kemikalij oziroma kovin23.

Prednost celičnih modelov in študij in vitro je, da predstavljajo alternativo poskusom na živalih, s čimer lahko zmanjšamo število usmrčenih živali in poenostavimo biološke sisteme v bolj obvladljive platforme za raziskave24. Celični modeli so namreč v skladu z načelom 3R (zamenjava (angl. Replacement), zmanjšanje (angl. Reduction) in izboljšanje (angl. Refinement)). V skladu s temi načeli je EU leta 2013 prepovedala trženje kozmetičnih izdelkov, ki so bili razviti s pomočjo študij na živalih, kar je sprožilo potrebo po učinkovitih alternativnih metodah raziskovanja25. Celični model mlečne žleze se največkrat uporablja za raziskovanje razvoja mlečne žleze, morfogeneze, karcinogeneze, izločanja mleka, povzročiteljev mastitisa in imunoloških odzivov. Kljub temu, da je koncept mlečne žleze kot mikrobnega habitata (z lastno mikrobioto in ne kot bakterijska kontaminacija), že uveljavljen, procesa kolonizacije mlečne žleze in morebitne tvorbe biofilmov še niso raziskovali. Najverjetneje gre razloge iskati tudi v pomanjkanju primernih, dobro proučenih celičnih modelov mlečne žleze.

Trajne humane celične linije epitelija mlečne žleze so komercialno dostopne na tržišču, kakor tudi brezplačno (http://hmec.lbl.gov/mock/descript.h...). Dobro proučen je na primer odziv (transkriptom) uveljavljene celične linije MCF10A med rastjo na poroznih membranah (sistem Transwell). Pri tem je najpomembneje, da celice med gojenjem na poroznih membranah diferencirajo v fazo, ki je podobna celicam epitelija v mlečnih vodih. Celice tvorijo tesne stike in s tem sloj z nizko prevodnostjo/prehodnostjo, kar je osnovna lastnost epitelne pregrade26-28. Poleg tega pride tudi do pomembnih sprememb v izražanju nekaterih skupin genov, kot so splošna supresija celičnega cikla in spremembe v izražanju genov, ki kodirajo proteine celičnega matriksa in citoskeleta. Zanimivo je, da so celice MCF10A, gojene na poroznih membranah, diferencirale v vsaj dve plasti, eno ki je izražala bazalne označevalce (CD10+, MUC1-) in drugo, ki je izražala luminalne označevalce (CD10-, MUC1+)26. Na vzdrževanje močne epitelne pregrade vpliva predvsem sestava medija na apikalni strani celic MCFA10A, kar potrjuje njihovo epitelno naravo26. Tovrstni sistem bi lahko bil uporaben tudi za simulacijo mikrobnega poseljevanja mlečne žleze na področju mlečnih vodov, podobno kot proučujejo procese v črevesju (npr. bakterijska citotoksičnost, adhezija,…) na celičnem modelu tankega črevesa25.

VIRI:

  1. Jeurink, P.V., et al. (2013). Human milk: a source of more life than we imagine. Benef Microbes, 4(1): 17-30.
  2. Jost, T., et al. (2013). Assessment of bacterial diversity in breast milk using culture-dependent and culture-independent approaches. Br J Nutr, 110(7): 1253-62.
  3. Heikkila, M.P., et al. (2003). Inhibition of Staphylococcus aureus by the commensal bacteria of human milk. J Appl Microbiol, 95(3): 471-478.
  4. Mackie, R.I., et al. (1999). Developmental microbial ecology of the neonatal gastrointestinal tract. Am J Clin Nutr, 69(5): 1035-1045.
  5. West, P.A., et al. (1979). Influence of methods of collection and storage on the bacteriology of human-milk. J Appl Bacteriol, 46(2): 269-277.
  6. Martin, R., et al. (2004). The commensal microflora of human milk: new perspectives for food bacteriotherapy and probiotics. Trends Food Sci Technol, 15(3-4): 121-127.
  7. Perez, P.F., et al. (2007). Bacterial imprinting of the neonatal immune system: lessons from maternal cells? Pediatrics, 119(3): 724-732.
  8. Jost, T., et al. (2013). Vertical mother-neonate transfer of maternal gut bacteria via breastfeeding. Environ Microbiol.
  9. Urbaniak, C., et al. (2014). Microbiota of Human Breast Tissue. Appl Environ Microb, 80(10): 3007-3014.
  10. Xuan, C.Y., et al. (2014). Microbial Dysbiosis Is Associated with Human Breast Cancer. Plos One, 9(1).
  11. Fernandez, L., et al. (2012). The human milk microbiota: origin and potential roles in health and disease. Pharmacol Res, 69: 1-10.
  12. Vuotto, C., et al. (2014). Probiotics to counteract biofilm-associated infections: promising and conflicting data. Int J Oral Sci, 6(4): 189-194.
  13. Cabrera-Rubio, R., et al. (2012). The human milk microbiome changes over lactation and is shaped by maternal weight and mode of delivery. Am J Clin Nutr, 96(3): 544-551.
  14. Collado, M.C., et al. (2012). Maternal weight and excessive weight gain during pregnancy modify the immunomodulatory potential of breast milk. Pediatr Res, 72(1): 77-85.
  15. Soto, A., et al. (2014). Lactobacilli and Bifidobacteria in Human Breast Milk: Influence of Antibiotherapy and Other Host and Clinical Factors. J Pediatr Gastr Nutr, 59(1): 78-88.
  16. Treven, P., et al. (2015). Administration of probiotics Lactobacillus rhamnosus GG and Lactobacillus gasseri K7 during pregnancy and lactation changes mouse mesenteric lymph nodes and mammary gland microbiota. J Dairy Sci, 98(4): 2114-28.
  17. Fernandez, L., et al. (2016). Prevention of Infectious Mastitis by Oral Administration of Lactobacillus salivarius PS2 During Late Pregnancy. Clin Infect Dis, 62(5): 568-573.
  18. Arroyo, R., et al. (2010). Treatment of infectious mastitis during lactation: antibiotics versus oral administration of lactobacilli isolated from breast milk. Clin Infect Dis, 50(12): 1551-1558.
  19. Jimenez, E., et al. (2008). Oral administration of Lactobacillus strains isolated from breast milk as an alternative for the treatment of infectious mastitis during lactation. Appl Environ Microb, 74(15): 4650-4655.
  20. Mastromarino, P., et al. (2015). Administration of a multistrain probiotic product (VSL#3) to women in the perinatal period differentially affects breast milk beneficial microbiota in relation to mode of delivery. Pharmacol Res, 95-96: 63-70.
  21. Chan, A.A., et al. (2016). Characterization of the microbiome of nipple aspirate fluid of breast cancer survivors. Sci Rep-Uk, 6.
  22. Urbaniak, C., et al. (2016). The Microbiota of Breast Tissue and Its Association with Breast Cancer. Appl Environ Microb, 82(16): 5039-5048.
  23. Reid, G. (2016). Can breast microbiota provide protective effects against cancer? Future Microbiol, 11(8): 987-989.
  24. Purup, S., et al. (2012). Cell-based models to test the effects of milk-derived bioactives. Animal, 6(3): 423-432.
  25. Langerholc, T., et al. (2011). Novel and established intestinal cell line models - an indispensable tool in food science and nutrition. Trends Food Sci Technol, 22(Suppl. 1): S11-S20.
  26. Marshall, A., et al. (2009). In vitro multipotent differentiation and barrier function of a human mammary epithelium. Cell Tissue Res, 335(2): 383-395.
  27. Pai, V.P., et al. (2008). Biphasic Regulation of Mammary Epithelial Resistance by Serotonin through Activation of Multiple Pathways. J Biol Chem, 283(45): 30901-30910.
  28. Stull, M.A., et al. (2007). Mammary gland homeostasis employs serotonergic regulation of epithelial tight junctions. P Natl Acad Sci USA, 104(42): 16708-16713.
  29. Marti, A., et al. (1997). Milk accumulation triggers apoptosis of mammary epithelial cells. Eur J Cell Biol, 73(2): 158-165.

Podroben opis vsebine in programa dela raziskovalnega projekta

Za dosego ciljev raziskave bomo uporabili trajno celično linijo MCF10A. MCF10A je že poznana in dobro proučena celična linija, ki pa še ni bila uporabljena za raziskave odnosov mikrobiota-gostitelj. Če celice MCF10A nasadimo na porozno membrano, izražajo močan polariziran fenotip, ki je značilen za celice epitelija mlečnih vodov26. Polarizacijo epitelija in tvorbo tesnih stikov bomo spremljali z merjenjem transepitelne električne upornosti (TEER). Polarizirane celice na poroznih membranah bomo izpostavili materinemu mleku (Slika 1). Ker želimo posnemati pretok mleka med dojenjem, bomo mleko zamenjali s svežim vsakih 4-8 ur. Ta inovativni korak je pomemben tudi zato, da preprečimo apoptozo celic zaradi zastajanja mleka29.

Za karakterizacijo modela MAGIC in proučevanje vpliva potencialnih probiotikov na epitelij bomo uporabili najsodobnejše metode:

  • za ugotavljanje in/ali kvantifikacijo sestave mikrobiote mleka in pripenjanja bakterij na epitelij – globinsko sekvenciranje 16S rDNA pomnožkov in s qPCR,
  • za proučevanje pripenjanja bakterij in tvorbe biofilma – vrstično elektronsko mikroskopijo,
  • za kvantifikacijo odziva epitnelne celične linije na vzorce mleka in pripete bakterije – analizo transkriptoma s RT-qPCR in/ali globinskim sekvenciranjem celokupne bakterijske RNA.

Delo na projektu (24 mesecev) bo organizirano v delovne sklope in mejnike, na podlagi katerih bomo lahko preverjali napredek našega dela. Glavni štirje delovni sklopi (DS) bodo naslednji:

DS 1: Osnovne priprave (mesec 1 – 4)

V prvih mesecih projekta bomo izvedli pred-poskuse na celicah MCF10A, ki jih bomo nasadili na porozne membrane. Glavni namen teh pred-poskusov je optimizirati pogoje gojenja in proučiti odziv celic na poroznih membranah po izpostavitvi bakterijskim kulturam in surovemu mleku in s tem doreči vse parametre ter osnovni protokol poskusa. Kot kontrolo bomo uporabili mleko sterilizirano na različne načine (s toploto, centrifugiranjem, anitbiotiki).

Poleg tega bomo v tem času pridobili dovoljenje etične komisije in v porodnišnici pridobili prostovoljke, ki bodo pripravljene darovati vzorce mleka. Cilj je pridobiti vsaj 15 zdravih, doječih mater, ki bodo vzorce mleka (≥25 ml/vzorec) darovale med 4-im in 8-im tednom po porodu. Pred odvzemom vzorca mleka, bodo prostovoljke seznanjene o poteku študije in dobile v podpis pisno privolitev k sodelovanju. Vzorce mleka bomo odvzeli s sterilno električno črpalko ali z ročnim iztiskanjem.

Cilji DS 1:

  • proučiti odziv epitelnih celic po izpostavitvi surovemu mleku in bakterijskim kulturam;
  • optimizacija in dokončanje protokolov študije;
  • pridobiti soglasje etične komisije;
  • zbrati vzorce mleka zdravih, doječih mater.

DS 2: karakterizacija modela MAGIC (mesec 5 – 14)

Celice MCF10A bomo nasadili na porozne membrane in jih gojili do konfluentnosti, kar bomo ugotovili z merjenjem TEER. Potem bomo gojišče na apikalni strani zamenjali s steriliziranim (kontrola) ali surovim materinim mlekom (Slika 1). Ker želimo posnemati pretok mleka med dojenjem, bomo mleko zamenjali s svežim vsakih 4-8 ur. Po 24 do 48-ih urah bomo analizirali:

  • Sestavo mikrobiote: v začetnih in končnih vzorcih mleka ter vzorcih epitelija bomo s qPCR in globinskim sekvenciranjem 16S rDNA pomnožkov, pridobili podatke o tem, katere bakterije so se pripele na epitelij.
  • Transkriptom epitelnih celic: z RT-qPCR in/ali globinskim sekvenciranjem bomo proučili vpliv mleka in njegove mikrobiote na odziv epitelnih celic mlečne žleze.
  • Površino epitelnih celic: z vrstičnimi elektronskim mikroskopom bomo preverili morebitno pripenjanje bakterij, ki so sestavni del mikrobiote humanega mleka in morebitno tvorbo biofilma na površini epitelija.

DS 2 vključuje več ciljev:

  • ugotoviti, katere bakterije, ki izvirajo iz mikrobiote materinega mleka, so se sposobne pripeti na celično linijo MCF10A, ki predstavlja epitelij mlečnih vodov;
  • oceniti, ali so te bakterije sposobne tvoriti biofilm;
  • oceniti, vpliv mikrobiote materinega mleka in pripetih bakterij na epitelne celice.

DS 3: Testiranje uporabnosti modela MAGIC (mesec 15 – 21)

V naslednjem sklopu bomo testirali uporabnost modela MAGIC za študij vpliva probiotikov in bakterijskih sevov, ki povzročajo mastitis. Na vzpostavljenem modelu testirali različne seve, ki povzročajo mastitis in potencialno probiotične seve, ki smo jih izolirali iz materinega mleka. Glavni cilj bo proučiti nivo pripenjanja teh sevov na epitelij in njihov vpliv na epitelij ter na vzpostavljajočo se mikrobioto. Določen sev ali konzorcij večih sevov bomo resuspendirali v vzorcih materinega mleka in opravili testiranja, podobno kot v sklopu DS2:

  • Sestavo mikrobiote: v začetnih in končnih vzorcih mleka ter vzorcih epitelija bomo s qPCR, pridobili podatke o tem, katere specifične vrste bakterij so se pripele na epitelij.
  • Vpliv na epitelne celice: z RT-qPCR bomo proučili vpliv testiranih sevov bakterij na epitelne celice. Glede na rezultate iz WP2 se bomo osredotočili na analizo izražanja specifičnih genov v eptelni celični liniji.

Cilji DS 3 so tako:

  • ovrednotiti uporabnost modela MAGIC;
  • oceniti, sposobnost pripenjanja testiranih bakterijskih sevov na epitelij MCF10A;
  • oceniti njihov vpliv na epitelne celice in na vzpostavljajočo se mikrobioto na epitelnih celicah.

DS 4: Sinteza in diseminacija (mesec 3 – 24)

Celoten delovni sklop bomo posvetili temeljiti sintezi zbranih podatkov in obsežni diseminaciji rezultatov. Vodja projekta se bo udeležil pomembnih mednarodnih konferenc kot so “Symposium on Lactic Acid Bacteria” in “Symposium of International Society for Research in Human Milk and Lactation”. V sodelovanju z ostalimi sodelujočimi raziskovalci bomo objavili članke in povzetke na konferencah, pri čimer bomo posebno pozornost posvetili dostopnosti rezultatov. Poleg tega bodo izsledki projekta objavljeni v spletnih znanstvenih portalih, kot sta npr. LinkedIn in ACADEMIA. V okviru spletne strani Inštituta za mlekarstvo in probiotike (www.iml-pro.si) bomo vzpostavili posebno podstran, posvečeno širjenju izsledkov in rezultatov predlaganega projekta. Za doseganje ciljnega občinstva, bomo v čakalnicah porodnišnic obesili poljudno-znanstvene plakate o raziskavah mikrobiote humanega mleka in s tem informirali tarčno skupino (nosečnice) o pomenu mikrobiote humanega mleka za razvoj novorojenca.

Pomen projekta za razvoj znanosti oziroma stroke

Mikrobiota mlečne žleze je lahko eden od pomembnih dejavnikov, ki je bil spregledan v preteklosti. Razumevanje mehanizmov poseljevanja mikrobiote mlečne žleze predstavlja ključni dejavnik pri razumevanju različnih procesov, ki se pojavljajo v mlečni žlezi. Temeljito proučen celični model bi tako predstavljal novo in vitro orodje pri raziskavah procesov mikrobnega poseljevanja mlečne žleze. Posledično bi takšno orodje predstavljalo trdne temelje za nadaljnje raziskave na številnih področjih fiziologije mlečne žleze, kot so na primer študije:

  • vplivov različnih bioaktivnih komponent mleka (različne frakcije mleka, oligosaharidi humanega mleka, bioaktivni peptidi, protimikrobne snovi,…) na razvoj mikrobiote mlečne žleze in na epitelne celice;
  • vplivov probiotikov in študije razvoja novih probiotičnih izdelkov, ki bi preprečevali in zdravili mikrobno disbiozo v mlečni žlezi;
  • tvorbe biofilmov neposredno na epitelnih celicah;
  • novih načinov aplikacije probiotikov dojenčkom, preko izkoriščanja retrogradnega toka;
  • vplivov mikrobiote mlečne žleze in specifičnih bakterijskih sevov na razvoj raka na dojkah;
  • celičnih modelov, ki so sestavljene iz več vrst celičnih kultur (co-culture models), kjer je mogoče proučevati odnose med bakterijami, epitelnimi celicami mlečne žleze in imunskimi celicami.

Poleg tega želimo s projektom preseči najsodobnejše dosežke na področju in prispevati nova spoznanja, ki bodo pomagala razumeti mikrobno poseljevanje mlečne žleze in pojav mikrobne disbioze in z njo povezanih bolezni. Tovrstna znanja bodo predstavljala osnovo za nadaljnje študije, ki bodo proučevale možnosti modulacije mikrobiote mlečne žleze na način, ki ugodno vpliva na zdravje mlečne žleze. Ker nedavne študije kažejo, da lahko nekatere bakterije v mlečni žlezi predstavljajo pomemben dejavnik pri razvoju raka dojke, bi tako in vitro orodje prineslo tudi nove možnosti za raziskave raka in še širši vpliv na znanstveno skupnost.

Neposredni pomen projekta za gospodarstvo in družbo

Da bi ustvarili zavest o pomenu raziskav za družbo, je v povezavi z razvojem projekta načrtovanih več dejavnosti ozaveščanja. Čeprav tema predlaganega projekta ne spada med aplikativne, ima velik potencial za družbeni in gospodarski vpliv, saj bi rezultati študije odprli nove možnosti za razvoj ne samo novih probiotikov za zdravljenje infekcij mlečne žleze, ampak tudi razvoj probiotikov, s katerimi lahko vplivamo na črevesno mikrobioto dojenčka in s tem na potek bolezni, ki so povezane s črevesno mikrobioto. Projekt bo omogočil razvoj novih učinkovin/probiotikov za razvoj otroških formul in povečal znanje o funkcionalnih učinkovinah v materinem mleku. Tako bo projekt imel neposredni učinek na dolgoročne, zdravstvene koristi mater, njihovih otrok in evropske družbe. Predlagani projekt bo okrepil hipotezo, da lahko sestavine materinega mleka uporabimo za mikrobiološko, imunološko in metabolno programiranje zdravja novorojenca in omogočil razvoj novih prehranskih strategij, funkcionalnih živil in terapij. Poleg tega bi lahko na dolgi rok, ugotovitve iz raziskav, ki temeljijo na MAGIC modelu, izboljšale razumevanje razvoja raka na dojki in posledično njegovega preprečevanja in zdravljenja.