Raziskave

REZISTOM - Rezistomi probiotičnih in starterskih kultur kot potencialni dejavnik tveganja za širjenje odpornosti proti antibiotikom

Intenzivna uporaba protimikrobnih zdravil  v medicini, veterini in intenzivni reji živali je v preteklih 50-ih letih s seboj prinesla problem razvoja odpornosti proti njim pri patogenih mikroorganizmih in zmanjšanje učinkovitosti zdravljenja infekcij, kar je Svetovna zdravstvena organizacija razglasila za eno od največjih groženj za zdravje. V preteklosti so že opozarjali na problem, da tudi komenzalne bakterije v živilski verigi lahko predstavljajo rezervoar za gene, povezane z odpornostjo proti antibiotikom (ARG), vendar do nedavnega še ni bilo na voljo tako naprednih in zmogljivih molekularnih metod in tehnologij, ki omogočajo razkrivanje celih bakterijskih genomov in mikrobiomov kompleksnih vzorcev, vključno z »rezistomom« - skupom vseh genov za AR, prisotnih v določenem okolju. V predlagani raziskavi se bomo osredotočili na bakterijske predstavnice starterskih kultur in probiotikov, ki jih namerno dodajamo v prehransko verigo. S pomočjo primerjalne genomske analize bomo raziskali njihova celotna genomska zaporedja (WGS), identificirali (in silico) ARG, mutacije in mobilne elemente ter ugotavljali skladnost rezultatov in silico napovedovanja odpornost proti antibiotikom z rezultati fenotipskega ugotavljanja. Izbrane vzorce živil preiskali z metagenomskim sekvenciranjem, s ciljem odkriti več tarčnih ARG in ugotoviti relativno zastopanost le-teh, ter oceniti prispevek dodanih probiotičnih in starterskih kultur k rezistomom preiskanih vzorcev živil. Pristop, predstavljen v raziskavi, bo omogočil učinkovitejše odkrivanje ARG v različnih rezistomih, povezanih z živili, ter boljše ocenjevanje tveganja za prenos ARG vzdolž živilske verige.

OSEBNA IZKAZNICA PROJEKTA:

Šifra projekta:          J4-1769
Tip Projekta:            Temeljni projekt
Trajanje projekta:   1.7.2019-30.6.2022   
Naslov projekta:      Rezistomi probiotičnih in starterskih kultur kot potencialni dejavnik tveganja za širjenje odpornosti proti antibiotikom
Financer:                   Javna agencija za raziskovalno dejavnost RS (ARRS)
Izvajalci:                    Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za zootehniko, Inštitut za mlekarstvo in probiotike)
                                    Nacionalni laboratorij za zdravje, okolje in hrano
                                    Univerza v Ljubljani, Veterinarska fakulteta, Inštitut za mikrobiologijo in parazitologijo
Vodja projekta:        znan. svet. dr. Bojana Bogovič Matijašić, univ. dipl. inž, živil. tehnol.

RAZISKOVALCI
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za zootehniko, Inštitut za mlekarstvo in probiotike
znan. svet. dr. Bojana Bogovič Matijašić, univ. dipl. inž. živil. tehnol. – vodja projekta;  prof. dr. Irena Rogelj, univ. dipl. inž. živil. tehnol.; univ. dipl. inž. živil. tehnol.; izr. prof. dr. Andreja Čanžek Majhenič, univ. dipl. inž. živil. tehnol.; asist. dr. Petra Mohar Lorbeg, univ. dipl. inž. živil. tehnol.; asist. dr. Primož Treven, univ. dipl. biokem.; dr. Diana Paveljšek, univ. dipl. inž. živil. tehnol.; Tanja Obermajer, univ. dipl. biol.; Vita Rozman, mag. biotehnol. – mlada raziskovalka

Nacionalni laboratorij za zdravje, okolje in hrano

prof. dr. Maja Rupnik, univ. dipl. biol.; doc. dr. Sandra Janežič, univ. dipl. mikrobiol.; asist. dr. Valerija Tkalec, univ. dipl. mikrobiol.; dr. Aleksander Mahnič

Univerza v Ljubljani, Veterinarska fakulteta, Inštitut za mikrobiologijo in parazitologijo
izr. prof. dr. Irena Zdovc, dr. vet. med.; prof. dr. Matjaž Ocepek, dr. vet. med.; Majda Golob, dr. vet. med





ZNANSTVENA IZHODIŠČA TER PREDSTAVITEV PROBLEMA


Intenzivna uporaba antibiotikov v medicini in veterini v preteklih 50-ih letih je s seboj prinesla problem razvoja odpornosti proti antibiotikom pri patogenih mikroorganizmih in zmanjšanje učinkovitosti zdravljenja infekcij. Naglo širjenje proti antibiotikom odpornih patogenih bakterij skupaj s pomanjkanjem razvoja novih antibiotikov vse bolj ogrožajo  javno zdravje. Ocenjujejo, da je 25.000 smrti v Evropski Uniji (EU) vsako leto posledica infekcij z bakterijami, odpornimi proti več protimikrobnim zdravilom. Razen tega neuspešnost protimikrobnih terapij močno obremenjuje tudi zdravstveni sistem in družbo, saj so letni izdatki za zdravstveno varstvo in izdatki zaradi zmanjšanja produktivnosti v EU ocenjeni na 1,5 milijarde €1. Znano je, da se patogene bakterije z odpornostjo proti antibiotikom (AR) pojavljajo vzdolž celotne agro-živilske verige, od rejnih živali, živilske industrije, živil, ljudi, do odplak, povezanih z živinorejo in živilsko industrijo2,3. Eden od poglavitnih virov tega problema je intenzivna reja živali za prehrano, predvsem zaradi uporabe antibiotikov v subterapevtskih odmerkih, ki spodbujajo razvoj proti antibiotikom rezistentnih bakterij. Z namenom omejevanja širjenja odpornosti so že leta 2006 v EU prepovedali uporabo antibiotikov v krmi za živali, za preventivo in za spodbujanje rasti. V EU potekajo tudi intenzivne aktivnosti v smeri zmanjševanja porabe antibiotikov v humani medicini4,5 in v veterini6. Znano je, da v določenih razmerah v okolju (selekcijski pritisk prisotnosti antibiotikov, gosta poseljenost okolja z mikroorganizmi, ipd.) geni za odpornost proti antibiotikom (angl. antibiotic resistance genes - ARG) lahko prehajajo med bakterijami različnih vrst ali rodov. Mehanizmi horizontalnega prenosa so za nekatere antibiotike precej dobro raziskani, predvsem v povezavi s patogenimi bakterijami, pogosto vpletenimi v bolnišnične infekcije. Prehajanje patogenih bakterij, ki so razvile AR proti večim antibiotikom in zaradi tega predstavljajo grožnjo za zdravje, vzdolž živilske verige, je problem, ki se ga že dolgo zavedajo in raziskujejo7. Na dejstvo, da tudi komenzalne bakterije v živilski verigi lahko predstavljajo rezervoar genov za odpornost proti antibiotikom in njihovo širjenje, so znanstveniki začeli opozarjati šele v zadnjem času8,9.

Mlečnokislinske bakterije (MKB) in bifidobakterije namerno vnašamo v živilsko verigo preko starterskih kultur za živila, probiotikov za ljudi ali krmnih dodatkov. Koncept Qualified Presumption of Safety (European Food Safety Authority-EFSA), ki postavlja kriterije za varnost bakterij, ki se v EU uporabljajo v živilski verigi (za hrano ali krmo), vsebuje zahtevo po odsotnosti pridobljenih ARG proti klinično pomembnim antibiotikom10,11. Že od leta 2001 dalje, ko so bile postavljene prve smernice za ugotavljanje narave odpornosti proti klinično pomembnim antibiotikom pri mikroorganizmih, ki jih uporabljajo kot krmne dodatke ali proizvodne organizme (SCAN – Scientific Committee on Animal Nutrition), jih EFSA redno posodablja11.

V preteklosti so AR ugotavljali izključno s fenotipskimi metodami, ki zahtevajo gojenje preskušanih sevov. Razvoj molekularnih metod v zadnjih letih pa je odprl tudi na področju ugotavljanja AR pri bakterijah veliko bolj celovit vpogled – bodisi preko primerjalne genomske analize celih bakterijskih genomov, kakor tudi preko metagenomskih analiz celotnih bakterijskih populacij različnih okolij (na primer prebavila, živila, odplake..)12–15. V povezavi z omenjenimi pristopi se je v zadnjem času udomačil izraz “rezistom16, s katerim opisujejo skup vseh genov za AR, ki so prisotni v določenem okolju oz. vzorcu, in jih lahko s sodobnimi in visokozmogljivostnimi molekularnimi metodami tudi odkrivamo, pri čemer nismo omejeni s kultivabilnostjo bakterij – torej sposobnostjo, da se razmnožujejo in zrasejo na gojišču.

Velik napredek na področju raziskovanja genomov mikroorganizmov in mikrobiomov različnih okolij narekuje nove pristope tudi pri raziskovanju mehanizmov AR ter prenašanja AR med bakterijami ter, širše, vzdolž agro-živilske verige.

Večina pomislekov glede varnosti bakterij, ki pridejo v živilsko verigo preko starterskih kultur in probiotičnih izdelkov, še vedno temelji na podatkih o fenotipski odpornosti posameznih sevov, ne pa na poznavanju celih genomov in rezultatih metagenomskih preiskav rezistomov vzorcev iz živilske verige. V EU je za dokazovanje odsotnosti pridobljenih genov, povezanih z odpornostjo proti klinično pomembnim antibiotikom, v zadnjih smernicah EFSA-FEEDAP (2018)11 priporočeno preiskovanje celih genomov komercialnih bakterij, vendar pri MKB in bifidobakterijah še ni bil implementiran v večjem merilu. Manjka tudi bolj celovit, globalen pristop k problematiki, tudi na področju probiotikov, ki so v mnogih pogledih sicer bolj nadzorovani kot starterske kulture, vendar smernice za presojanje varnosti probiotikov (FAO/WHO) niso bile posodobljene že od leta 2002.

Odpornost proti antibiotikom v EU redno obravnavajo tudi v posodobitvah seznama varnih organizmov (QPS), namerno dodanih hrani ali krmi. Kriteriji za fenotipsko občutljivost z ugotavljanjem minimalne inhibitorne koncentracije (MIK) pri posameznih sevih pa so na voljo le za omejeno število antibiotikov, to je 9 za ne-enterokokne, 10 za Enterococcus faecium, 8 za bifidobakterije11. Ker komenzalnih bakterij ne raziskujejo v takem obsegu kot klinično pomembne, podatki o MIK (minimalnih inhibitornih koncentracijah) in o prisotnosti ARG v komenzalnih bakterijah vključno s kulturami za živilsko industrijo in probiotiki niso tako obsežni in zato kriteriji morda niso dovolj ustrezni za vse bakterijske vrste in vse antibiotike.

V preteklosti je bilo preiskovanje sevov omejeno ali na fenotipsko ugotavljanje ali pa na prisotnost omejenega števila najbolj »rizičnih« genov, za katere so v preteklosti že dokazali, da se lahko horizontalno prenašajo med bakterijami. Zavedati pa se je potrebno, da tudi če posamezne bakterije ne izkazujejo fenotipske odpornosti proti posameznim antibiotikom, še vedno lahko vsebujejo v genomu genske elemente, ki so povezani z AR. Razen tega v različnih okoljskih vzorcih niso vse bakterije v kultivabilnem stanju – torej jih ni mogoče gojiti, kar zahtevajo tradicionalne metode ugotavljanja AR. Na drugi strani pa se moramo zavedati, da tudi če so v komenzalnih bakterijah prisotni prenosljivi geni, je dejansko tveganje za prenos še premalo raziskano, morda celo precenjeno.
Mikroorganizmi iz starterskih kultur, ki jih uporabljajo v industrijski proizvodnji živil (fermentacija in oblikovanje senzoričnih lastnosti), praviloma sicer slabše od probiotikov preživijo prehod skozi prebavila in redkeje naselijo črevo, pa vendar lahko vnesejo v ta ekosistem DNA, ki se sprosti iz neživih celic in lahko vsebuje genetske elemente, povezane z AR. Dejansko pa s prehrano po vsej verjetnosti vnesemo v telo veliko večjo količino starterskih bakterij (žive, nežive) ali njihovega genetskega materiala, kot pa probiotičnih. V starterskih in probiotičnih kulturah so najpogostejši predstavniki rodov Lactobacillus in Lactococcus, pri katerih je odpornost proti nekaterim antibiotikom kar razširjena17. Tudi glede na trende, da se bo vse več probiotikov tržilo na farmacevtskem področju, je nujno hitro ukrepanje.

Razkrivanje rezistomov bakterij lahko pomaga pri presojah varnosti uživanja mlečnokislinskih bakterij in bifidobakterij oziroma izdelkov iz njih (fermentirana živila, probiotični izdelki..) oz. potencialnega tveganja v smislu širjenja AR vzdolž živilske verige. Predstavlja tudi korak k uspešnejšemu, bolj poglobljenemu raziskovanju prenašanja AR iz komenzalnih na patogene bakterije znotraj gostitelja (v prebavilih ljudi ali živali).


CILJI PROJEKTA


  • C1: pridobiti nove podatke o prisotnosti genov, povezanih z AR (rezistom), v celotnih genomih predstavnikov starterskih kultur in probiotičnih kultur, na podlagi že objavljenih ali v tem projektu pridobljenih genomskih sekvenc, in in silico analizami z različnimi bioinformacijskimi orodji in podatkovnimi zbirkami;
  • C2: obogatiti mednarodno bazo podatkov o MIK antibiotikov, pomembnih v medicini in veterini, za predstavnike laktobacilov in bifidobakterij, kar je pomembno za postavljanje mejnih vrednosti MIK, ki služijo za presojanje narave odpornosti (pridobljena ali prirojena) oziroma interpretacijo fenotipskih testiranj;
  • C3: ugotoviti skladnost rezultatov in silico napovedovanja prisotnosti ARG in mutacij v celih genomih preiskanih sevov, z rezultati fenotipskega ugotavljanja občutljivosti za izbrane antibiotike;
  • C4: raziskati rezistome izbranih fermentiranih in probiotičnih izdelkov (iz živalskih surovin, ki vsebujejo znane starterske ali probiotične kulture), s ciljanim metagenomskih sekvenciranjem, podprtim s kvantifikacijo s PCR v realnem času;
  • C5: na podlagi vseh rezultatov oceniti obremenjenost probiotičnih in starterskih kultur z geni, povezanimi z odpornostjo proti antibiotikom, ter oceniti prispevek dodanih probiotičnih in starterskih kultur k rezistomom preiskanih vzorcev živil.


IZVEDBA PROJEKTA


    Glavni delovni sklopi (DS):

    • DS1: izolacija, identifikacija in fenotipsko ugotavljanje AR,
    • DS2: sekvenciranje celih genomov in bioinformacijska analiza,
    • DS3: in silico detekcija ARG in mutacij,
    • DS4: razvoj in validacija kvantifikacije izbranih tarčnih ARG s qPCR,
    • DS5: metagenomsko sekvenciranje vzorcev živil z bioinformacijsko analizo,
    • DS6: sinteza rezultatov in diseminacija (pisanje člankov, konference).




RELEVANTNOST IN POTENCIALNI VPLIV REZULTATOV



    Kljub temu da so osnovne zahteve za varnost vseh mikroorganizmov, ki jih namerno uvedemo v prehrano, v EU že dolgo postavljene, v okviru koncepta QPS (2007)10, razmere na trgu kažejo, da še ni ustrezne kontrole vseh izdelkov (industrijske kulture in končni izdelki), ki vsebujejo žive mikroorganizme. Odkar je stopila v veljavo zakonodaja o zdravstvenih trditvah na živilih, so se zahteve za probiotične mikroorganizme, ki vključujejo tudi tveganje za prenos antibiotične rezistence,  zaostrile, pričakujemo pa lahko, da bo v bližnji prihodnosti bolj zakonsko urejeno tudi področje starterskih kultur za živilsko industrijo in končnih izdelkov. Zato pa je potrebno oceniti dejansko stanje glede razširjenosti AR v segmentu starterskih kultur, izdelkov iz njih in probiotikov ter razviti nove, sodobne pristope za njeno ugotavljanje.  Rezultati predlaganega projekta bodo prispevali k temu, da bomo v Sloveniji pravočasno pripravljeni na zaostrene zahteve glede varnosti mikroorganizmov, namerno uvedenih v prehransko verigo, oziroma celo korak pred drugimi državami.

    Tematika prijavljene raziskave prispeva k družbenemu cilju “Protimikrobna odpornost”, natančneje zmanjšanje prenosa odpornih bakterij, v okviru katerega je posebna pozornost posvečena nadaljnjim raziskavam, ki pojasnjujejo, kako se odpornost razvije in širi v okolju, ter razvoju diagnostičnih orodij in boljših metod nadzora tega pojava.  V programih EU posvečajo problemu naraščajoče AR pri bakterijah veliko pozornost (Programme H2020-EU.3.1. - SOCIETAL CHALLENGES - Health, demographic change and well-being)16. Tudi Svetovna zdravstvena organizacija (WHO) je razglasila problem širjenja AR med  največje grožnje za zdravje v prihajajočem obdobju. V okviru projekta bodo vpeljani novi pristopi in metode za ugotavljanje AR (rezistomski pristop, primerjalna genomika), kar je pomembno tudi s stališča raziskovalne odličnosti sodelujočih ustanov.


VIRI


1
ECDC, Antimicrobial  resistance surveillance in Europe 2015. Annual Report of the European Antimicrobial Resistance Surveillance Network (EARS-Net). Stockholm: ECDC; 2017. https://doi.org/10.2900/6928

2ECDC/EFSA/EMA. ECDC/EFSA/EMA second joint report on the integrated analysis of the consumption of antimicrobial agents and occurrence of antimicrobial resistance in bacteria from humans and food-producing animals. EFSA Journal. 2017;15:4872. https://doi.org/10.2903/j.efsa.2017.4872

3Alakomi, H. L. et al. 2016. Quality Assurance and Safety of Crops & Foods, 8, 399 – 413. https://doi.org/10.3920/QAS2014.0576

4Communication from the Commission to the European Parliament and the Council. http://ec.europa.eu/dgs/health_food-safety/docs/communication_amr_2011_748_en.pdf

5Strategic research agends – JPIAMR. http://www.jpiamr.eu/wp-content/uploads/2014/05/SRA1_JPIAMR.pdf

6Guidelines for the prudent use of antimicrobials in veterinary medicine, Official journal of the EU, 2015/C 299/04.

7Verraes, C. et al. 2013. International Journal of Environmental Research and Public Health, 10, 2643-2669. https://doi.org/10.3390/ijerph10072643

8Rolain, J. M. 2013. Frontiers in Microbiology, 4, 10. https://doi.org/10.3389/fmicb.2017.01406

9Gueimonde, M. et al. 2013. Frontiers in Microbiology, https://doi.org/10.3389/fmicb.2013.00202

10European Food Safety Authority (EFSA). 2007. Introduction of a Qualified Presumption of Safety (QPS) approach for assessment of selected microorganisms referred to EFSA. The EFSA Journal, 587, 1-16.

11EFSA FEEDAP. 2018. Guidance on the characterisation of microorganisms used as feed additives or as production organisms. EFSA Journal 16(3):5206, 24 pp. https://doi.org/10.2903/j.efsa.2018.5206   

12Penders, J. et al. 2013. Frontiers in Microbiology, 4. https://doi.org/10.3389/fmicb.2013.00087

13Pärnänen, K. et al. 2018. Nature Communications, 9, https://doi.org/3891. 10.1038/s41467-018-06393-w

14Duranti, S et al. 2017. Applied and Environmental Microbiology, 83. UNSP e02894-16. https://doi.org/10.1128/AEM.02894-16  

15Rodríguez, C. et al. 2019. https://doi.org/10.21775/9781910190890.

16Wright, G. D. 2010. The antibiotic resistome. Expert Opinion on Drug Discovery, 5, 779-788. https://doi.org/10.1517/17460441.2010.497535

17Devirgiliis, C., Zinno, P. & Perozzi, G. 2013. Frontiers in Microbiology, 4, 13. https://doi.org/10.3389/fmicb.2013.00301